22-04-2023
ДНК-гира́за (или просто гира́за) — фермент бактерии E. coli и других прокариот, относится к группе топоизомераз, вызывающий образование отрицательных супервитков в релаксированной кольцевой молекуле ДНК. Хотя ДНК-гираза относится к топоизомеразам типа II и так же, как они, вносит двуцепочечные разрывы в ДНК, она осуществляет это без затрат энергии АТФ[1].
В 2007 году гираза была описана у паразитического простейшего Plasmodium falciparum из типа Апикомплексы. В отличие от гиразы E. coli, она требует затрат АТФ[2].
Бактериальная ДНК-гираза необходима для протекания репликации ДНК. Она является мишенью многих антибиотиков, например, налидиксовой кислоты, новобиоцина[en] и ципрофлоксацина.
ДНК-гираза была описана в М. Геллертом с соавторами в 1976 году[3].
В общих чертах механизм действия ДНК-гиразы таков. Она взаимодействует с ДНК так, что ДНК наматывается вокруг неё. В тех местах ДНК, что связаны с гиразой, возникает положительная сверхспирализация. После этого фермент вносит в ДНК двуцепочечный разрыв и переносит двойную нить с внутренней стороны на внешнюю. После этого гираза сшивает оба разрыва, превращая, таким образом, положительные супервитки в отрицательные[1]. Скорость работы гиразы достигает около 100 супервитков в минуту[3].
Описанная выше модель действия ДНК-гиразы подтверждается рядом экспериментальных данных. Известно, что вокруг фермента обвивается часть ДНК длиной приблизительно 120 н. п. Точнее, гираза представляет собой тетрамер, и ДНК соединяется с ферментом в двух сайтах. Было также обнаружено, что взаимодействие ДНК и фермента не ограничивается внесением двуцепочечного разрыва: 5'-конец ДНК связывается с 122 аминокислотным остатком (тирозин) гиразы (субъединица А, см. ниже), а 3'-OH конец остаётся свободным. Поскольку связывание ДНК и гиразы является специфическим, в ДНК E. coli было обнаружено 2 специфических сайта со следующей консенсусной последовательностью[en]: 5'-RNNNRNNRTGRYCTYNYNGNY-3'[4].
Было установлено, что разрыв происходит между нуклеотидами TG (выделено выше). Во всём геноме E. coli предположительно имеется порядка 45—50 крупных сайтов связывания с ДНК-гиразой, однако это не означает, что все они функциональны. Имеется также почти 10 тысяч сайтов, где имеется слабое связывания ДНК и гиразы. Это означает, что крупные сайты составляют приблизительно 0,5% от всех возможных сайтов связывания. Однако даже эти сайты в подавляющем большинстве случаев не проявляют никакой активности и работают лишь когда гираза находится в чрезвычайно высокой концентрации[4].
Известно, что для образования двух отрицательных супервитков (то есть для осуществления одного каталитического цикла) необходимо 2 молекулы АТФ. Однако эксперименты по работе гиразы в условиях наличия и отсутствия АТФ дали непредвиденные результаты. Как и предполагалось, наличие АТФ способствует образованию отрицательных супервитков ДНК, но в отсутствие АТФ отрицательные супервитки раскручивались. Из этого следует, что функция гиразы по внесению двуцепочечных разрывов ни активируется, ни находится в зависимости от наличия АТФ[4]. Однако для нормальной работы гиразы АТФ всё-таки необходима.
Гираза E. coli состоит из двух субъединиц: А (GyrA) и В (GyrB). Они гомологичны белкам С и Е топоизомеразы IV[en], а также С- и N-концевым доменам эукариотической топоизомеразы II[en] соответственно[5]. Было показано, что субъединица В обладает очень слабой АТФазной активностью, которая очень сильно стимулируется наличием субстрата (то есть АТФ), ДНК и субъединицы А. Субъединица А вносит двуцепочечный разрыв (для этого процесса АТФ не нужен), субъединица В переносит одну из цепей (это осуществляется с затратой АТФ), а затем субъединица А сшивает цепи. Опытным путём было установлено, что активация фермента происходит лишь тогда, когда обе его субъединицы свяжутся с ДНК[4].
Как было показано выше, гираза обладает способностью релаксировать положительные супервитки, заменяя их отрицательными. Это делает гиразу чрезвычайно важной для процесса репликации ДНК. Когда по ДНК движется ДНК-полимераза, впереди фермента образуются положительные супервитки, поскольку спираль ДНК правозакручена. Создающееся таким образом напряжение препятствует дальнейшему продвижению ДНК-полимеразы. Эта проблема решается гиразой (а также топоизомеразой IV), релаксирующей положительные супервитки. Таким образом, гираза играет важную роль как в инициации, так и в элонгации и терминации репликации[1].
Гираза имеется у прокариот и некоторых эукариот, однако у разных видов эти ферменты имеют разную аминокислотную последовательность и пространственную структуру. ДНК-гираза отсутствует у человека, в связи с чем её удобно использовать в качестве мишени для антибиотиков. Существует два класса антибиотиков, направленных на подавление гиразы:
Помимо ДНК-гиразы, индуцирующей образование отрицательных супервитков, существует также обратная гираза, вызывающая образование положительных супервитков. На данный момент обратная гираза обнаружена у всех гипертермофильных организмов, в то время как ДНК-гираза обнаружена лишь у мезофилов. Обратная гираза имеется как у бактерий, так и у архей, однако ДНК-гираза обнаружена только у бактерий, хотя у галофильных архей выявлены гены, предположительно кодирующие ДНК-гиразу. Наличие обратной гиразы у термофильных архей связывают с наличием у них генетических элементов (плазмид, вирусных ДНК) в уникальной положительно закрученной форме, в то время как плазмиды мезофильных архей и бактерий отрицательно закручены[5].
Обратная гираза представляет собой уникальную комбинацию классической топоизомеразы I типа и белкового комплекса с хеликазными свойствами. ДНК-гираза, напротив, принадлежит к классическому семейству топоизомераз II типа, однако обладает уникальной способностью образовывать положительный тороидальный супервиток в сегменте ДНК[5].
