12-10-2023
Секвенирование нового поколения — техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.
Содержание |
Первая концепция секвенирования была предложена Сэнгером в 1977 году[1]. Технология получила название «метод обрыва цепи». В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации». Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление ПЦР и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллелировании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.
Все основные принципы работы технологий СНП базируются на секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные циклические ферментативные реакции с дальнейшим сбором полученной информации в виде иллюстраций. Полученные данные используются для восстановления нуклеотидной последовательности или, как для технологии SOLiD, динуклеотидных «цветов». Несмотря на разные методы получения копий (амплификация) участков генома и на техническую разницу дифференциации различных нуклеотидов в прочтенных последовательностях, общая схема работы для всех секвенаторов одна. Первый этап секвенирования — создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет сшить с общедоступными адаптерными последовательностями. Второй этап — создание ампликонов с помощью ПЦР, которые будут использованы как образцы. Третий этап — определение первичной структуры всех фрагментов.
| метод | принцип | длина одного прочтения | стоимость 1 млн п.о. | стоимость секвенатора | время работы за цикл | количество прочтений за цикл | преимущества | недостатки |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 454 Life Sciences | пиросеквенирование | 400 баз | 10$ | 500 000$ | 7 часов | 1 000 000 | длина прочтенных геномных участков; скорость | стоимость; погрешность |
| Illumina-SOLEXA | SBS (sequncing-by-synthesis) | 300 баз | 0,05-0,15$ | 600 000$ | 9 дней | до 3 000 000 | эффективность | стоимость |
| IonTorrent | ионный полупроводник | 200 баз | 1$ | 50 000$ | 1,5 часа | до 5 000 000 | стоимость; скорость | погрешность |
| SOLiD | секвенирование на основе лигирования | 35-50 баз | 0,13$ | 595 000$ | 9 дней | 1 300 000 000 | стоимость | скорость |
| Helicos | HeliScope | 2900 баз | 2$ | 1 час | 35 000 — 75 000 | длина прочтенных геномных участков; скорость | низкая производительность при желаемой малой погрешности; стоимость |
В связи со стремительным развитием методов секвенирования, параметры методов, такие как стоимость секвенаторов и их работы, время и длины прочтенных участков, могут меняться. Актуальная информация доступна в современных источниках.[2][3]
Первая эффективно используемая на коммерческой основе платформа СНП. Компания 454 Life Sciences основана в 2000 году Джонатаном Ротбергом (в производство запущена в 2005 году). Данная технология представляет собой последовательный синтез методов эмульсионного ПЦР и пиросеквенирования.
Амплификация ДНК проходит в каплях воды в масляной эмульсии. В каждой капле воды находится одноцепочечная матрица ДНК, связанная с праймером на бусинке. Далее, каждая бусина помещается на чип, представляющий собой оптическое волокно. Туда же помещаются необходимые для секвенирования ферменты: ДНК-полимераза, люцифераза, АТФ-сульфурилаза. В последней сборке реакция секвенирования идет в ячейках объемом 3.4*10^6 пкл, на стенках которых есть специальное металлическое покрытие, нивелирующее шум.
Авторы метода — британские химики Шанкар Баласубраманиан и Дэвид Кленерман. Этот метод[4] секвенирования использует прикрепленные к микросферам единичные молекулы ДНК. В 2006 году была запущена Solexa Genome Analyzer 1G, первая платформа, генерирующая короткие участки генома. После ее приобретения компанией Illumina Genome Analyzer использует оптически прозрачные ячейки с 8 индивидуальными поверхностями, где связываются олигонуклеотиды. В отличие от пиросеквенирования удлинение последовательности происходит постепенно, что позволяет за раз с помощью камеры снимать большие ДНК-чипы.
Платформа SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation and Detection System 2.0), разработанная Applied Biosystems (http://www.solid.appliedbiosystems.com) - технология секвенирования коротких ридов, основанная на лигировании. Метод был предложен в лаборатории Георга Черча и опубликован в 2005 году (был заново просеквенирован геном Escherichia coli). По технологии SOLiD при секвенировании фрагменты ДНК лигируются на олигонуклеотидные адаптеры, прикрепленные к шарикам, далее они амплифицируются с помощью эмульсионной ПЦР.
Первый метод секвенирования единичных молекул, разработанный HeliScope (Helicos BioSciences (http://www.helicosbio.com)) даёт информации около 1Gb/день. Принцип работы: после клональной амплификации образца происходит фрагментация ДНК с последующим полиаденилированием на 3'-конце с дальнейшим секвенированием, чередующимся с промыванием образцов нуклеотидами с флуоресцентной меткой.
Метод одномолекулярного секвенирование в реальном времени (англ. Single molecule real time sequencing или SMRT) основан на наблюдении за работой единичной молекулы ДНК-полимеразы . Использование четырех флюоресцентно меченных нуклеотидов позволяет определить какой нуклеотид присоединяет ДНК-полимераза в данный момент времени.
Метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов. Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать, и таким образом различать нуклеотиды.
Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq. Более того, с его помощью можно изучать и микробиальные геномы, и транскриптомы.
Метод основан на измерении тока ионов через единичную нанопору в непроводящей мембране. При прохождении через эту пору нуклеотидов ток падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.
Быстрота и дешевизна методов СНП, недоступная ранее, спровоцировала бум в индустрии геномных исследований. Благодаря СНП появилась возможность делать ранее технически недоступные эксперименты[5][6][7].
Стали доступны геномы разных по сложности живых систем от микробов до человека, включая геном цитогенетически находящихся в норме клеток миелоидной лейкемии. Увеличение длины ридов ускорило сборку целых геномов.
Секвенирование определенных регонов в геномах используется для выявления полиморфизмов (в частности однонуклеотидых полиморфизмов) и мутаций в генах, задействованных в развитии опухолевых и других заболеваний. Примером одной из таких широкомасштабных работ может служить проект 1000 геномов.
Использование СНП позволило определять места связывания белков с ДНК (ChIP-seq), взаимодействующие участки ДНК (Определение конформации хромосом) и участки открытого хроматина на протяжении всего генома.
Удешевление и распространение СНП позволяет осуществлять проекты ENCODE и modENCODE.
СНП широко используется в исследованиях разнообразия микроорганизмов в различных образцах (например, микробные популяции в океане и почве, идентификация новых вирусов в органах, подлежащих трансплантации, описание характерной для ЖКТ микрофлоры и т. д.)
На основе СНП создан новый подход РНК-секвенирования (RNA-seq)[8] для картирования и подсчета транскриптов в биологических образцах. У этого метода есть преимущества над используемым ранее ДНК-микрочипов. Например, ДНК-чипы зависят от перекрытия геномных последовательностей, в то время как RNA-seq позволяет охарактеризовать транскрипцию без предварительного знания места начала транскрипции.
Идентификация регуляторных белков, ассоциированных с геномами, было значительно ускорено с помощью введения в лабораторную практику иммунопреципитации хроматина и гибридизации на микрочипах.
Методы секвенирования нового поколения.