17-06-2024
Протеиназа K (протеаза K, эндопептидаза K; 3.4.21.64)[1] — сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album (Tritirachium album)[2].
Протеиназа К способна расщеплять кератин, основной белок волос, отсюда и пошло её название. Основные участки в пептиде, распознаваемые и гидролизуемые протеиназой, — пептидные связи, соседствующие с карбоксильной группой алифатических и ароматических аминокислот с закрытой альфа-амино-группой. Широко используется благодаря её широкой специфичности.
Протеиназа К состоит из 384 аминокислот. Для ферментативной активности требует присутствие ионов Ca2+ (1 - 5 mM). Протеиназы K содержит два сайта связывания ионов Ca2+, которые расположены вблизи активного центра, но не принимают непосредственного участия в каталитической реакции. Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобных аминокислоты). Белки полностью расщепляются, при длительной инкубации или при высокой концентрации протеиназы К. После удаления ионов кальция, стабильность фермента снижается, но протеолитическая активность остается. Удаление ионов Ca2+ снижает каталитическую активность протеиназы К на 80%, но остаточной активности вполне достаточно для расщепления белков [3]. Поэтому, протеиназу К можно использовать для очистки нуклеиновых кислот в присутствии ЭДТА (ингибирующий магний-зависимых ДНКаз).
В молекулярной биологии протеиназа К широко применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК.
Повышение температуры реакции от 37°C до 60°C увеличивает активность протеиназы K в несколько раз, как и при добавление 0,5 - 1% SDS или гуанидина хлорида (до 3 M) или гуанидина тиоционата (до 1 M) или мочевины (до 4 M) [4]. Так как повышается доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.
Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум - pH 8.
Температура выше 65°C или присутствие трихлоруксусной кислоты или сериновых протеаз-ингибиторов AEBSF, PMSP или DFP ингибируют активность.
Протеиназы К не ингибируется в присутствии гуанидина хлорида, гуанидина тиоционата, мочевины, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, EDTA, цитрат, йодуксусной кислоты и, а также в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, как Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) и Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK).
Активность протеиназы К в стандартных буферах
| Буфер (pH 8.0, 50°C, 1.25 мкг/мл протеиназы К, 15 мин инкубации) | Активность протеиназы К (%) |
| 30 mM Tris·Cl | 100 |
| 30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; 0.5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% Tween 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.45% Tween 20; 0.5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |
Протеиназа для выделения нуклеиновых кислот, протеиназа k купить.
Человек, который видел будущее, Шаблон:Чемпионат Европы по дзюдо среди слепых и слабовидящих, Бежевый цвет.